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人外周血淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)
 
【包裝規(guī)格】
 200ml/瓶
 【貨號(hào)】
 LTS1077
 【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
 A． 適用儀器
 zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
 B．耗材

 
全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
 
首先根據(jù)樣本量大小，分以下幾種情況：
 
一、 使用 15ml 離心管時(shí)：
 
情況 A：血液樣本量小于 3ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
 
1. 取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液。
 
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到分離效果）。
 
3. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
 
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中 加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
 
5. 250g，離心 10min。
 
 6. 棄上清。
 
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
 
8. 250g，離心 10min。
 
9. 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。 情況 B：血液樣本量為 3-6ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
 
1. 取一支 15ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
 
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，450-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到分離效果，但zui大離心力不超過(guò) 1200g）。
 
3. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
 
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中 加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
 
5. 250g，離心 10min。
 
6. 棄上清。
 
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
 
8. 250g，離心 10min。
 
9. 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
 
二、 使用 50ml 離心管時(shí)：
 
情況 A：血液樣本量為 6-10ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
 
1. 取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
 
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-950g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到分離效果，但zui大離心力不超過(guò) 1200g）。
 
3. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
 
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中 加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
 
5. 250g，離心 10min。
 
 6. 棄上清。
 
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
 
8. 250g，離心 10min。
 
9. 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。 情況 B：血液樣本量為 10-20ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
 
1. 取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
 
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-1100g，離心 20-30min（注：根據(jù) 血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條 件需客戶自行摸索，以達(dá)到分離效果，但zui大離心力不超過(guò) 1200g）。
 
3. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
 
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中 加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
 
5. 250g，離心 10min。
 
6. 棄上清。
 
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
 
8. 250g，離心 10min。
 
9. 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
 
【注意事項(xiàng)】
 
1. 全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
 
2. 本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
 
3. 吸取過(guò)多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒
 
細(xì)胞數(shù)量增加。
 
4. 吸取過(guò)多的淋巴細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
 
5. 如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)以尋求幫助，具體
 
詳見(jiàn)下方生產(chǎn)企業(yè)信息。

 
6. 當(dāng)血液樣本粘度過(guò)高需稀釋時(shí)，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)： 2010C1119）1:1 稀釋混勻備用。注：不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞?huì)降低細(xì)胞得率及活性。如血液樣
 
本經(jīng)過(guò)稀釋則分離過(guò)程中需適當(dāng)降低離心力和離心時(shí)間。
 
【儲(chǔ)存條件及有效期】
 
18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟 封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。 【參考值（參考范圍）】
 
本實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞提取率及純度均大于 80%。
 1. 所獲得淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
 
2. 所獲得淋巴細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
 
3. 所獲得淋巴細(xì)胞的鑒定方法 A.流式細(xì)胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù)
 
C.原位雜交技術(shù)
 
D.PCR 技術(shù) 注：上述技術(shù)方案詳情請(qǐng)登陸本搜索“細(xì)胞
 
分離、純化、擴(kuò)增及鑒定指導(dǎo)手冊(cè)"，并在說(shuō)明書(shū)項(xiàng)目欄下下載使用。 
【可能存在的問(wèn)題及解決方法】
1.由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：

 
 
 
2. 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離 心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
 
3. 本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可
 
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
 
注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到分離效果，離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。