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蛋白質轉印法檢定蛋白質

更新時間：2012-08-14　點擊量：3234

蛋白質經SDS-PAGE后，膠片浸入轉印緩沖液，蛋白質可被轉印到硝化纖維紙（nitrocellulose）上，先經?素洗去SDS，并使蛋白質回?原態抗原性，可使用抗體進?免疫染色（Towbin et al, 1979）。

儀器用具：電泳轉印槽（Hoefer Transphor TE 52）：轉印槽（可容納4 個轉印三明治）轉印三明治（轉印夾、方形海綿墊2 片）轉印紙：早期使用硝化纖維紙，現在多用尼龍材質者Immobilon P （Millipore IPUH 000 10, 0.45 μm, PVDF 材質）濾紙（Whatman #1, 3MM）兩張，裁成比轉印紙稍大者。供電器（可供400~500 mA者）方形培養皿（轉印紙清洗用）旋轉搖蕩器（rotary shaker）

藥品試劑：

轉印緩沖液（Blotting buffer）：10×溶液

Tris （Tris base, 25 mM×10） 60.6 gm

甘胺酸（0.192 M×10） 288 gm加水1,500 mL 溶的，pH 以HCl 調到8.3，加水至 2,000 mL 使用時取500 mL 倒入一5 L 桶中，加500 mL 甲醇后，加水到5 L，均勻攪拌的。如此配成者，含10%甲醇；?是轉印勝或是蛋白質的分子?太小，可提高到20%。

甲醇（用?潤濕尼龍材質的轉印紙）

PBST 洗液：PBST 為pH 7.0 的PBS （phosphate buffered saline）緩沖液，另加有0.05%Tween-20，用?清洗轉印紙，以去除非專一性的蛋白質吸附。

?素洗液（6M Urea-PBST） :?素180 gm 溶在300 mL PBST 中，加溫攪拌溶解，再加PBST 至500 mL。

方法步驟：

◆ 全程請戴手套操作，以免污染轉印紙！

1）電泳后SDS-PAGE 膠片浸在轉印緩沖液中，洗2~3 次，每次10 min。

2）取出轉印槽，先小心放一攪拌子在底部，再倒一半轉印緩沖液。

◆ 攪拌子千萬?能丟到轉印槽內，會打破轉印槽底部的陶瓷散熱片。

3）取轉印紙切成約如膠片大小，先在方形培養皿中以少許甲醇浸濕數秒鐘，再置入轉印槽中的緩沖液10 min 后使用。另取兩張濾紙，以及兩片方形海綿墊，?放在轉印槽的緩沖液中備用。

4）取出轉印夾打開平放，先墊一張方形海棉墊，鋪上一張濕濾紙，小心迭上已潤濕的轉印紙，其間勿陷入氣泡；轉印紙再滴上數滴緩沖液后，小心平鋪膠片上去，加蓋一層濾紙，及另一張海綿，也??可陷入氣泡，即可把整個轉印三明治卡夾裝好。

◆ 膠片迭到轉印紙時，一次成功，?要重作，否則蛋白質色帶可能會印上去，zui后產生重迭影像。

5）將轉印三明治置入已經放有一半轉印緩沖液的轉印槽中，注意有轉印紙的那一面向正極（紅色），膠片那面向負極（黑色）。

6）當三明治?放入轉印槽后，以轉印緩沖液蓋滿所有的三明治，小心動一動卡夾，除去附在卡夾內外的氣泡，蓋上蓋子，放到一攪拌器上，打開攪拌器開始攪拌，同時接好電源，裝置完成后放置10 min。

7）以400 mA 開始轉印，溫?會漸漸上升，轉印1.5 h 后中止轉印，取出轉印三明治，打開后依次取出轉印紙及膠片。

◆ 上述轉印條件會使溫?上升至70~90℃，?有?卻系統，可把溫?控制設在5℃；轉印槽內應該加以攪拌，以?使整個溫?分布均勻。

8）轉印后的膠片可以繼續進?CBR 染色，看有無蛋白質殘?。 ?電泳時加有藍色標準蛋白質marker （SeeBlue），則可在轉印紙上看到藍色的色帶，確定轉印成功，并可評估轉印效?。

9）轉印紙浸在約15 mL ?素洗液中浸洗過夜，期間換三次?素洗液，并且要溫和搖蕩的。

10） ??做免疫染色，則轉印后?用?素洗液清洗，以清水沖過后改用amido black （l %溶于10%甲酸）染色1 h，再以10%甲酸脫色，沖水后晾干即可，但其?敏?較低。

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